【基因測(cè)序是什么】基因測(cè)序有什么用 基因測(cè)序原理技術(shù)

隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和費(fèi)用的降低，現(xiàn)在普通人也可以在可承受的經(jīng)濟(jì)范圍內(nèi)進(jìn)行個(gè)體測(cè)序分析，測(cè)序技術(shù)成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展和個(gè)體化治療中一個(gè)非常重要的工具，我們即將迎來(lái)一個(gè)全民測(cè)序的時(shí)代。而這樣一種強(qiáng)大的工具在科學(xué)家們的手中又可以發(fā)揮出更大價(jià)值，挖掘出更有深度的信息?；驕y(cè)序技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中得到了哪些應(yīng)用呢？小編從以下幾個(gè)方面結(jié)合已發(fā)表文章進(jìn)行了總結(jié)。

基因測(cè)序助力癌癥研究尋找治療靶點(diǎn)

在2016年4月8日那期Science期刊上，美國(guó)布羅德研究所Aviv Regev的領(lǐng)導(dǎo)的癌癥研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)與麻省理工學(xué)院副教授、單細(xì)胞分析先鋒Alex Shalek合作，利用單細(xì)胞RNA-seq方法每次一個(gè)細(xì)胞地研究整個(gè)腫瘤以便確定哪些類型的細(xì)胞存在于腫瘤中。他們不僅分析了惡性腫瘤細(xì)胞，而且也分析了腫瘤內(nèi)所有不同類型的細(xì)胞。這是首次開(kāi)展這樣的研究。如今，他們知道每種腫瘤的細(xì)胞組成，也知道每種類型的細(xì)胞的基因表達(dá)模式，這樣就能夠回個(gè)頭去重新分析一些大體積腫瘤測(cè)序數(shù)據(jù)（比如，癌癥基因組圖譜）以便從現(xiàn)存的數(shù)據(jù)中找出細(xì)胞如何相互作用和一定程度上利用細(xì)胞重建大塊腫瘤樣品的整體行為。

在一篇發(fā)表在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Communication上的文章中，來(lái)自美國(guó)的科學(xué)家們對(duì)109名胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）病人進(jìn)行了全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了PDA中的基因突變多樣性，并且為發(fā)現(xiàn)PDA治療靶點(diǎn)提供了重要信息。

在該項(xiàng)研究中，研究人員為方便檢測(cè)基因突變，同時(shí)移除非腫瘤性組織的污染，他們利用顯微切割的方法將癌癥患者的腫瘤組織進(jìn)行了異種移植并建立了細(xì)胞系。隨后對(duì)109例進(jìn)行過(guò)顯微切割的PDA病例進(jìn)行了全外顯子測(cè)序，經(jīng)過(guò)顯微切割操作后，腫瘤細(xì)胞得到富集并增強(qiáng)了對(duì)基因突變的檢測(cè)。研究人員通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致PDA發(fā)生的病因事件與腫瘤突變譜具有明顯相關(guān)性。

基因測(cè)序幫助尋找生物標(biāo)記物 助力疾病診斷

在歐洲泌尿外科協(xié)會(huì)的研究者公布的一項(xiàng)最新研究成果中，研究者對(duì)64份前列腺組織樣本進(jìn)行研究，對(duì)每一種樣本中的2億個(gè)序列進(jìn)行閱讀分析，結(jié)果研究者發(fā)現(xiàn)在腫瘤和控制樣本中有超過(guò)2000個(gè)基因都表現(xiàn)出了明顯的差異性，其中有些相比已知的前列腺癌標(biāo)志物而言表現(xiàn)出了較高的特異性和敏感性;其中一種名為T(mén)APIR的非編碼RNAs則可以有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，盡管其可以轉(zhuǎn)化為臨床有用的治療靶點(diǎn)還為時(shí)尚早。

研究者在前列腺癌患者的尿液中發(fā)現(xiàn)了這些生物標(biāo)志物，檢測(cè)結(jié)果顯示其可以幫助進(jìn)行準(zhǔn)確的前列腺癌檢測(cè)，基于相關(guān)研究結(jié)果，研究人員決定開(kāi)發(fā)一種進(jìn)行前列腺癌早期診斷的高特異性及敏感性的，且基于尿液的檢測(cè)手段;這種檢測(cè)方法基于對(duì)多個(gè)生物標(biāo)志物的組合，相比單一標(biāo)志物而言將表現(xiàn)出較高的特異性。

基因測(cè)序幫助監(jiān)測(cè)全球性疾病暴發(fā)

在一篇發(fā)表于Nature雜志上的報(bào)道中，來(lái)自伯明翰大學(xué)的研究人員解釋了如何利用基因組測(cè)序的技術(shù)來(lái)快速實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病暴發(fā)的有效監(jiān)測(cè);文章中他們開(kāi)發(fā)了一種手提箱式的基因組測(cè)序“實(shí)驗(yàn)室”，其中包含有一種新型的DNA測(cè)序儀，最初該設(shè)備用于2015年4月在幾內(nèi)亞對(duì)埃博拉病人的樣本進(jìn)行檢測(cè)。

這項(xiàng)研究中，研究人員利用這種便攜式的DNA測(cè)序儀在整個(gè)基因組庫(kù)中鑒別出了新型的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），目前當(dāng)測(cè)序工作局限于實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候，這種便攜式機(jī)器的開(kāi)發(fā)對(duì)于有效進(jìn)行疾病暴發(fā)的監(jiān)測(cè)而言非常重要，研究者們還希望可以將這種便攜式的機(jī)器應(yīng)用于別的領(lǐng)域的研究中，比如癌癥研究等。

在另外一項(xiàng)研究中，來(lái)自英國(guó)牛津大學(xué)和巴西Evandro Chagas研究所等機(jī)構(gòu)的研究人員對(duì)巴西的寨卡病毒暴發(fā)進(jìn)行首個(gè)基因組分析，從而提供關(guān)于這種病毒如何和何時(shí)可能進(jìn)入美洲方面的新信息。

研究人員對(duì)7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進(jìn)行測(cè)序，包括一株毒株來(lái)自一例致命的成年人病例和另一株毒株來(lái)自一名頭小畸型新生兒。

1、第一代測(cè)序

1.1 Sanger 測(cè)序

采用的是直接測(cè)序法。1977年，F(xiàn)rederick Sanger 等發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術(shù)隨后成為最為常用的基因測(cè)序技術(shù)。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 發(fā) 明了 Sanger 測(cè)序法，并在此后的 10 年里成為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。其基本原理即雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每當(dāng) DNA 鏈加入分子 ddNTP，延伸便終止。每一次 DNA 測(cè)序是由 4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)組成，將模板、引物和 4 種含有不同的放射性同位素標(biāo)記的核苷酸的 ddNTP 分別與DNA 聚合酶混合形成長(zhǎng)短不一的片段，大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的 DNA 片段存在于反應(yīng)體系中，具有單個(gè)堿基差別的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來(lái)，得到放射性同位素自顯影條帶。依據(jù)電泳條帶讀取 DNA 雙鏈的堿基序列。

人類基因組的測(cè)序正是基于該技術(shù)完成的。Sanger 測(cè)序這種直接測(cè)序方法具有高度的準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)。目前，依然對(duì)于一些臨床上小樣本遺傳疾病基因的鑒定具有很高的實(shí)用價(jià)值。例如，臨床上采用 Sanger 直接測(cè)序 FGFR 2 基因證實(shí)單基因 Apert 綜合征和直接測(cè)序 TCOF1 基因可以檢出多達(dá) 90% 的與 Treacher Collins 綜合征相關(guān)的突變。值得注意的是，Sanger 測(cè)序是針對(duì)已知致病基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行 PCR 直接擴(kuò)增測(cè)序。單個(gè)突變點(diǎn)的擴(kuò)增包括該位點(diǎn)在內(nèi)的外顯子片段即可，不必將該點(diǎn)所在基因的全部外顯子都擴(kuò)增。

因此，應(yīng)明確定位要擴(kuò)增的位點(diǎn)所在的基因外顯子和該點(diǎn)的具體位置，設(shè)計(jì)包括該點(diǎn)在內(nèi)的上下游 150 ~ 200 bp 的外顯子片段引物。此外，盡管有NGS 的出現(xiàn)，但 Sanger 測(cè)序?qū)τ谟兄虏』蛭稽c(diǎn)明確并且數(shù)量有限的單基因遺傳疾病的致病基因的檢測(cè)是非常經(jīng)濟(jì)和高效的。到目前為止，Sanger 測(cè)序仍然是作為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，也是 NGS 基因檢測(cè)后進(jìn)行家系內(nèi)和正常對(duì)照組驗(yàn)證的主要手段。

值得注意的是，Sanger 測(cè)序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基因突變。對(duì)于沒(méi)有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的，此類測(cè)序研究還要依靠具有高通量測(cè)序能力的 NGS。雖然 Sanger 測(cè)序具有高度的分析準(zhǔn)確性，但其準(zhǔn)確性還取決于測(cè)序儀器以及測(cè)序條件的設(shè)定。另外，Sanger 測(cè)序不能檢測(cè)出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基因突變的類型，因此對(duì)于一些與此相關(guān)的遺傳性疾病還不能做出基因?qū)W診斷。

1.2 連鎖分析

采用的是間接測(cè)序法。在 NGS 出現(xiàn)之前，國(guó)際通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大規(guī)模全基因掃描和連鎖分析基礎(chǔ)上的位置候選基因克隆。人類的染色體成對(duì)出現(xiàn)，一條來(lái)自父親，一條來(lái)自母親，每一對(duì)染色體在同樣的位置上擁有相同的基因，但是其序列并不完全相同，被稱為父系和母系等位基因。遺傳標(biāo)記是指在人群中表現(xiàn)出多態(tài)現(xiàn)象的 DNA 序列，可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它存在于每一個(gè)人，但大小和序列有差別，具有可遺傳性和可識(shí)別性。目前采用第二代遺傳標(biāo)記，即重復(fù)序列多態(tài)性，特別是短串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記。連鎖分析是以連鎖這種遺傳現(xiàn)象為基礎(chǔ)，研究致病基因與遺傳性標(biāo)記之間關(guān)系的方法。如果控制某一表型性狀的基因附近存在遺傳標(biāo)記，那么利用某個(gè)遺傳標(biāo)記與某個(gè)擬定位的基因之間是否存在連鎖關(guān)系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體某一位置上。1986 年 Morton 等提出優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)記分法（og odds score method，LOD），主要檢測(cè)兩基因以某一重組率連鎖時(shí)的似然性。LOD 值為正，支持連鎖；LOD 值為負(fù)，則否定連鎖。通過(guò)計(jì)算家系中的微衛(wèi)星標(biāo)記與致病位點(diǎn)之間的 LOD 值，可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度，從而確定該基因在染色體上的粗略位置。然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜，分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因的功能與表達(dá)，選擇合適的候選基因進(jìn)行突變檢測(cè)，最終將致病基因定位或克隆。

然而，采用連鎖分析進(jìn)行基因檢測(cè)存在很大的局限性。不但所需遺傳樣本量較大，一般要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣，而且數(shù)據(jù)量大、處理復(fù)雜、產(chǎn)出速度較慢、定位不夠精確（一般只能定位在染色體某一區(qū)間），這就使得研究工作繁重和定位基因的時(shí)間周期特別長(zhǎng)。目前，連鎖分析采用的單核苷酸多肽性和短串聯(lián)重復(fù)序列還在使用，但經(jīng)典的間接測(cè)序方法，如單鏈構(gòu)象多肽性、變性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國(guó)已被淘汰，而在發(fā)展中國(guó)家作為研究手段還在有限使用。

2、新一代測(cè)序（NGS）

主 要 包 括 全 基 因 組 重 測(cè) 序（whole-genomesequencing，WGS）、全外顯子組測(cè)序（whole-exomesequencing，WES）和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序（Targeted regionssequencing，TRS），它們同屬于新一代測(cè)序技術(shù)?？傮w而言，NGS 技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，使得遺傳學(xué)者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位。但這些不同的測(cè)序技術(shù)在測(cè)序范圍、數(shù)據(jù)分析量以及測(cè)序費(fèi)用和時(shí)間等方面又有很大差別，如果選擇適合的方法，對(duì)于臨床診斷和科學(xué)研究將起到事半功倍的作用。

2.1 目標(biāo)區(qū)域測(cè)序

目前常用的是基因芯片技術(shù)。其測(cè)序原理是基于 DNA 雜交原理，利用目標(biāo)基因組區(qū)域定制的探針與基因組 DNA 進(jìn)行芯片雜交或溶液雜交，將目標(biāo)基因區(qū)域 DNA 富集，再通過(guò)NGS 技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。其測(cè)序過(guò)程是通過(guò)把數(shù)以萬(wàn)計(jì)的 cDNA 或寡聚核苷酸置于芯片上制成列陣，將芯片上固定好的已知序列的核苷酸探針與溶液中含有熒光標(biāo)記的相應(yīng)核酸序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，根據(jù)測(cè)序儀所顯示強(qiáng)熒光的位置和強(qiáng)度，獲取每組點(diǎn)陣列信息，再利用生物信息學(xué)算法確定目的靶核苷酸的序列組成。測(cè)序所選定的目標(biāo)區(qū)域可以是連續(xù)的 DNA 序列，也可以是分布在同一個(gè)染色體不同區(qū)域或不同染色體上的片段。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)，對(duì)于以往通過(guò)連鎖分析將基因突變鎖定在染色體某一片段區(qū)域內(nèi)，但無(wú)法找出突變是一個(gè)非常好的進(jìn)一步檢測(cè)手段。2010 年，Nicholas等使用基因分型芯片聯(lián)合連鎖分析技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)頭小畸形的新基因 WDR62，文章發(fā)表在《NatGenet》雜志。類似的研究在家族性胰腺癌中確定 8 個(gè)候選變異位點(diǎn)和在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)現(xiàn)易感基因 TSPAN12。

基因芯片測(cè)序技術(shù)可以將經(jīng)過(guò)連鎖分析鎖定了目標(biāo)范圍或經(jīng)過(guò)全基因組篩選的特定基因或區(qū)域進(jìn)行更深一層的研究，是解決連鎖分析無(wú)法發(fā)現(xiàn)致病基因的有效手段?；蛐酒夹g(shù)對(duì)于已知基因突變的篩查具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以快速、全面地檢測(cè)出目標(biāo)基因突變。同時(shí)，由于目標(biāo)區(qū)域受到了限制，測(cè)序范圍大幅度減少，測(cè)序時(shí)間和費(fèi)用相應(yīng)降低。但基因芯片檢測(cè)所需要的 DNA 的量要大，由于已提取的 DNA 存在降解的風(fēng)險(xiǎn)，用于基因芯片研究的血標(biāo)本最好是冰凍的全血，這樣可以使用于檢測(cè) DNA 的量有充分保證。

2.2 全外顯子組測(cè)序 （WES）

外顯子組是單個(gè)個(gè)體的基因組 DNA 上所有蛋白質(zhì)編碼序列的總合。人類外顯子組序列約占人類全部基因組序列的 1%，但大約包含 85% 的致病突變。WES 是利用序列捕獲技術(shù)將全外顯子區(qū)域 DNA 捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因分析方法。采用的技術(shù)平臺(tái)主要是羅氏公司的 SeqCap EZ 全外顯子捕獲系統(tǒng)，Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)和 Agilent 公司的 SureSelect 外顯子靶向序列富集系統(tǒng)。其捕獲的目標(biāo)區(qū)在 34 ~ 62 M 之間，不僅包括編碼區(qū)同時(shí)也加入了部分非編碼區(qū)。NGS 的測(cè)序過(guò)程主要包括DNA 測(cè)序文庫(kù)的制備、錨定橋接、PCR 擴(kuò)增、單堿基延伸測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。研究者根據(jù)測(cè)序儀捕獲到在測(cè)序過(guò)程中摻入有不同熒光標(biāo)記堿基片段，經(jīng)計(jì)算機(jī)將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成不同顏色的測(cè)序峰圖和堿基序列?；驕y(cè)序結(jié)果與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等國(guó)際權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，最終確定是否為突變基因。

自NGS 技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，利用 WES 在臨床疾病致病基因的鑒定研究中取得前所未有的成果。這些成果不僅集中在單基因遺傳疾病，還在多基因影響的復(fù)雜疾病中獲得大量相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。在單基因遺傳性疾病中，如視網(wǎng)膜色素變性、終端骨發(fā)育不良等發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。在一些罕見(jiàn)的疾病中，如 Kabuki 綜合征、家族性混合型低脂血癥和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥等疾病中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。同時(shí)，在小細(xì)胞肺癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等腫瘤研究和諸如肥胖癥、腦皮質(zhì)發(fā)育不良等復(fù)雜疾病的研究中也取得豐碩成果。

WES 技術(shù)在篩查范圍和檢出率等方面較其他測(cè)序技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。例如，對(duì)于采用 Sanger測(cè)序和基因芯片測(cè)序不能篩查出基因的樣本，可以采用 WES 來(lái)進(jìn)一步基因篩查鑒定。應(yīng)用 WES技術(shù)能夠獲得較傳統(tǒng) Sanger 等方法對(duì)編碼區(qū)測(cè)序更深的覆蓋度和更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。由于信息量的大幅度增加，WES 可以獲得更多個(gè)體的編碼區(qū)信息，因此成為檢測(cè)致病基因和易感基因位點(diǎn)的有效手段。與連鎖分析定位方法比較，WES 對(duì)家系的要求并不十分嚴(yán)格，在單基因遺傳病同一家系中有 2 ~3 個(gè)患者和 1 個(gè)正常人即可進(jìn)行致病基因的鑒定研究，而不需要連續(xù)三代的遺傳家系。由于不需要嚴(yán)格的三代以上的遺傳家系，WES 使以前不能進(jìn)行研究的家系成為可能。不僅對(duì)于單基因遺傳病是一個(gè)很好的研究手段，對(duì)于許多常見(jiàn)病，如腫瘤、糖尿病等疾病也可進(jìn)行大規(guī)模比較研究。

2.3 全基因組重測(cè)序 （WGS）

WGS 是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的全基因組的測(cè)序，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析后對(duì)序列進(jìn)行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對(duì)不同組織進(jìn)行測(cè)序并分析體細(xì)胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個(gè)體基因組上的所有突變，從而找到個(gè)體間的差異，但對(duì)于外顯子以外的區(qū)域則不能有效地進(jìn)行基因檢測(cè)。對(duì)于此種情況，目前還要借助WGS 進(jìn)行全基因組檢測(cè)。但由于人類基因組過(guò)于龐大，一次單端全基因組測(cè)序很難達(dá)到所需要的測(cè)序深度。因此，需要重復(fù)測(cè)序或雙端測(cè)序，由此帶來(lái)測(cè)序成本的大幅度提高和由于不能達(dá)到足夠的測(cè)序深度所導(dǎo)致的結(jié)果準(zhǔn)確性的降低。而對(duì)于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測(cè)費(fèi)用也是難以承受的。盡管如此，對(duì)于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進(jìn)行更加全面的基因檢測(cè)。

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